Attività anafilattica di frazioni proteiche di estratti tonsillari

Attività anafilattica di frazioni proteiche di estratti tonsillari

1960

RIASSUNTO

E' stata studiata l'attività antianafilattica di estratti di tonsilla di bue. Dai dati ottenuti risulta che l'effetto è prevalentemente dovuto ai costituenti proteici presenti nell'estratto. A mezzo di precipitazioni frazionate con solfato di ammonio è stato dimostrato che la maggiore attività antianafilattica è posseduta da quei costituenti proteici che hanno le caratteristiche delle globuline.

Il fenomeno della deanafilassi o antianafilassi come molti autori preferiscono definirlo, è di antica osservazione e si può dire che esso sia stato osservato sin dai primordi degli studi sull'anafilassi. Indubbiamente si tratta di un fenomeno la cui importanza è di vastissima portata, dal punto di vista teorico, perché contribuisce alle acquisizioni sull'anafilassi, dal punto di vista pratico per la sua importanza connessa con alcuni aspetti della professione medica. Dalle prime memorie pubblicate da Otto, Rosenau ed Anderson, da Besredka, da Gay e Southard ad oggi numerose sono le nozioni che si sono acquisite, pur tuttavia molti lati ancora permangono oscuri e ciò non per mancanza di sperimentazione, ma piuttosto a causa della complessità del problema.

Dopo le promettenti constatazioni sulla desensibilizzazione dell'animale operata da antigeni con carattere di specificità, si è cercato di indagare a fondo su quei costituenti di varia natura e diversa composizione i quali esercitano un'azione similare.

Una desensibilizzazione, seppure non completa, può essere ottenuta ad esempio con mezzi fisici; così molti anni or sono Pasteur e Vallery-Radot osservarono che in animali sensibilizzati si può attenuare o addirittura prevenire lo shock qualora venga modificata la temperatura corporea, sia nel senso dell'aumento che della diminuzione.

Fra le sostanze chimiche si annoverano talune soluzioni colloidali, quali il saccarato di ferro, la gomma arabica, il destrano, l'inchiostro di china, e soluzioni a tipo cristalloidale, quali ad esempio il cloruro di calcio, il cloruro di sodio, il tiosolfato di calcio o di magnesio.

Azione desensibilizzante posseggono alcuni sieri immuni, così il siero anti-antigene di Forssman ed alcune sostanze azotate; tra queste ultime soprattutto il peptone che quando viene inoculato per via venosa determina in taluni animali uno stato morboso simile, per taluni aspetti, allo shock anafilattico, e per circa tre settimane dopo l'inoculazione del peptone l'animale mostra una completa insensibilità ad ulteriori inoculazioni.

Tutte queste sostanze agiscono in maniera aspecifica, cioè esse non intervengono nella complessa reazione antigene-anticorpo. Poiché è ben noto che l'anafilassi è condizionata alla liberazione di istamina, tutte queste sostanze agiscono o bloccando la produzione di questa amina o la sua liberazione dai tessuti (Benaceraff e Fischel, Friedman e Silverman).

In un precedente lavoro noi abbiamo riportato i risultati di una indagine sperimentale compiuta al fine di studiare se estratti di tonsilla possono, in via aspecifica, interferire nei fenomeni anafilattici, ciò in base alle osservazioni cliniche relative al fatto che l'asportazione delle tonsille condiziona nell'organismo la comparsa di una aumentata sensibilità in senso anafilattico. In base alle nostre esperienze abbiamo potuto dimostrare che nella cavia sensibilizzata con siero di cavallo la inoculazione di estratto tonsillare, effettuata, poco tempo prima della iniezione scatenante, è capace di attenuare la crisi anafilattica sia generale che localizzata. Abbiamo anche osservato che il potere antianafilattico dell'estratto di tonsilla è prevalentemente legato ai costituenti proteici, i quali in adeguate concentrazioni sono da considerarsi come desensibilizzanti aspecifici.

In questo lavoro abbiamo voluto approfondire le nostre conoscenze sull'azione antianafilattica dell'estratto di tonsilla ed abbiamo creduto opportuno di intraprendere ricerche per precisare la natura del principio attivo antianafilattico presente nella tonsilla.

Materiale e metodi

Come già descritto in un lavoro precedente ci siamo serviti di tonsille di bue, le quali venivano prelevate dall'animale non appena era terminata la mattazione. Il materiale veniva lavato con soluzione fisiologica al fine di allontanare l'emoglobina e privato dei tralci fibrosi connettivali, dopo di che era immerso in un recipiente contenente azoto liquido. Questa modifica, rispetto alla conservazione in cella a zero gradi, come descritto precedentemente, ci ha consentito di ridurre al minimo le alterazioni a carico dei costituenti biochimici in esame. Tutte le susseguenti operazioni sono state effettuate in stanza fredda condizionata alla temperatura di +2 gradi C. Per la preparazione dell'estratto si è proceduto alla seguente maniera: 100 grammi di tonsille venivano omogeneizzate in Varing Blendor aggiungendo un po' per volta puffer di fosfati a pH 7 fino ad un volume di 500 cc. L’omogenato veniva filtrato attraverso un panno di flanella e poi per carta da filtro; infine, dopo aver allontanato il materiale grossolano non passato in sospensione, la parte liquida veniva raccolta e centrifugata in centrifuga refrigerata a +2° C alla velocità di 3000 giri al minuto per circa 60 minuti primi.

Il sedimento era scartato ed il liquido sopranatante era sottoposto ad una ulteriore centrifugazione di 120 minuti alla velocità di 20.000 giri al minuto al fine di allontanare la parte corpuscolata costituita dai nuclei, dai mitocondri e dalla frazione pesante dei microsomi. Il liquido soprastante contiene tutte le proteine solubili del tessuto tonsillare.

Poiché in una precedente ricerca abbiamo potuto dimostrare che l'attività antianafilattica è posseduta esclusivamente dalla frazione proteica dell'estratto tonsillare, in questa ricerca abbiamo rivolto la nostra attenzione alla sola quota proteica e da essa abbiamo cercato di separare il principio attivo.

Si è pertanto proceduto ad una precipitazione frazionata con solfato, di ammonio. Al fine di non determinare fenomeni di denaturazione si è sempre lavorato alla temperatura di +2° C e si sono impiegate soluzioni di solfato di ammonio tamponate a pH 7.

La quantità di solfato di ammonio era tale (e cioè 0,25 cc di una soluzione satura di sale- 76 gr. %- per ogni cc; di estratto) da ottenere una saturazione finale corrispondente allo 0.20. Si lasciava riposare, per 60 minuti circa e dopo il precipitato veniva raccolto in centrifuga refrigerata alla velocità di 3000 giri al minuto per 40 minuti. Alla fine della centrifugazione il precipitato era raccolto e veniva disciolto in piccolo volume di acqua distillata. Esso costituisce la frazione 0.2.

Il sopranatante era ancora trattato con una soluzione di solfato d'ammonio saturo in quantità di cc. 0,66 per ogni centimetro cubico. Si raggiungeva pertanto una saturazione del sale pari allo 0,4; si lasciava riposare per circa un'ora e dopo si raccoglieva in centrifuga il sedimento, che veniva disciolto in piccolo volume di acqua distillata. Esso costituisce la frazione 0,4.

Il sopranatante era ancora una volta trattato con la soluzione satura di solfato di ammonio: per ogni cc di esso si aggiungeva cc. 1,5 della soluzione salina in maniera che la saturazione finale del solfato d'ammonio era corrispondente allo 0,6. Dopo un'ora circa il precipitato abbastanza voluminoso era raccolto in centrifuga refrigerata e veniva disciolto in piccolo volume di acqua distillata. Esso costituisce la frazione 0,6.

Al sopranatante infine veniva addizionato una notevole quantità della soluzione satura di solfato di ammonio- cioè 4 cc. della soluzione satura del sale per ogni cc. - in maniera da raggiungere una concentrazione finale del sale corrispondente allo 0,8 di saturazione. La precipitazione in questo caso cominciava subito dopo l'aggiunta del sale e si rendeva massivamente evidente dopo circa dieci minuti. Si lasciava tuttavia riposare per circa un'ora, come nelle manipolazioni precedentemente descritte, e dopo il precipitato bianco, fioccoso veniva raccolto in centrifuga. Esso era disciolto in piccolo volume di acqua distillata e costituisce la frazione 0,8.

Le quattro frazioni venivano poste a dializzare prima contro acqua corrente per circa dodici ore e poi contro acqua distillata al fine di allontanare dalla parte colloidale proteica tutta la parte cristalloidale costituita dall'eccesso di solfato di ammonio.

L'allontanamento completo del sale era seguito effettuando dei prelievi a tempo determinato ed eseguendo una reazione con il reattivo di Nessler. In genere dopo 24 ore di dialisi il sale era tutto allontanato in quanto non otteneva più la caratteristica reazione giallo-oro per aggiunta del Nessler. Le frazioni venivano pertanto raccolte dai tubi di dialisi e liofilizzate.

Come precedentemente descritto lo studio dell'anafilassi è stato effettuato impiegando delle cavie le quali venivano preventivamente sensibilizzate con una iniezione endovenosa di 0,1 cc di siero di sangue di cavallo. Dopo dieci dodici giorni si procedeva al saggio anafilattico. Anche, in questo lavoro abbiamo preferito seguire l'andamento della reazione sia da un punto di vista generale che locale pertanto dopo la iniezione sensibilizzante gli animali erano inoculati sia per via endovenosa che localmente per reazione intradermica. Nel primo caso quando la reazione risultava positiva si assisteva all'instaurarsi di un tipico shock anafilattico più o meno classico a seconda della quantità del materiale inoculato; nel secondo caso la positività della reazione era condizionata alla presenza di una papula a carattere eritematoso con tendenza all'infiltrazione delle zone circostanti.

Al fine di evitare l'insorgenza di fatti infiammatori collegati alla presenza di germi, la cute del dorso dell'animale veniva depilata con pomata al polisolfuro ed accuratamente lavata e disinfettata.

Il potere antianafilattico delle frazioni dell'estratto tonsillare è stato saggiato inoculando quantità diverse, per via endovenosa, trenta minuti prima della iniezione scatenante. Al fine di ottenere risultati al massimo comparabili tra di loro, si è prima proceduto alla determinazione della percentuale proteica, mediante reazione colorata di Biureto, dell'estratto tonsillare, e poi le singole frazioni venivano pesate e disciolte in una quantità tale di tampone di fosfati in maniera da ottenere per ognuna di esse la stessa concentrazione in proteina dell'estratto tonsillare in toto.

Risultati

Nella tabella I sono riportati i risultati relativi alle inoculazioni dell'estratto tonsillare in toto. Come si osserva nella tabella la comparsa di un vero e proprio shock anafilattico, (indicato con +++) è in parte prevenuta soltanto quando viene raggiunta una buona concentrazione proteica dell'estratto tonsillare. In alcune prove collaterali abbiamo potuto accertale che la massima effettività dell'estratto tonsillare corrisponde ad una concentrazione proteica che è presso a poco equivalente a quella del siero di sangue.

Lo stesso si verifica qualora l'inoculazione è fatta per via intradermica, in quanto la papula eritematosa è parzialmente prevenuta dall'inoculazione di una adeguata quantità di estratto tonsillare. Dai dati riportati nella tabella risulta anche che vi è una perfetta corrispondenza tra i fenomeni a carattere generale e quelli a carattere locale.

TABELLA I.

Reazione generale Reazione locale shock papula Controllo + + + + (siero di cavallo) + + + + + + + + Estratto in toto + + + + O,1 cc. + + + + + + + + Estratto in toto + + + + 0,25 cc. + + + + -+ + + Estratto in toto + + + + 0,50 cc. - + + + - + - + Estratto in toto + + + + 0,75 cc. - + - + - + - + Estratto in toto ~ - + - + 1 cc. - + - + - + - +

Nella tabella II sono riportati i dati relativi all'attività antianafilattica della frazione 0,2.

Da quanto riportato nella tabella II risulta che la frazione 0,2 da sola, anche se inoculata in adeguata concentrazione, non è capace di prevenire né l'instaurarsi di uno shock né la formazione della papula.

Si è soltanto osservato un'attenuazione di una parte sintomatologica, specialmente nella fase iniziale dello shock.

TABELLA II.

	Reazione generale	Reazione locale
	shock	papula
Controllo	+ +	+ +
(siero di cavallo)	+ +	+ +
	+ +	+ +
Estratto tonsillare in toto	- +	- +
cc. 1	- +	- +
	+ +	+ +
Frazione 0,2	+ +	+ +
cc. 0,25	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 0,2	+ +	+ +
cc. 0,50	+ +	+ +
	++	++
Frazione 0,2	+ +	+ +
cc. 0,75	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 02	- +	+ +
cc. 1 '	+ +	+ ++

Nella tabella III sono invece riportati i risultati ottenuti sperimentando l'attività antianafilattica della frazione 0,4.

TABELLA III.

	Reazione generale	Reazione locale
	shock	papula
Controllo	+ +	+ +
(siero di cavallo)	+ +	+ +
	+ +	+ +
Estratto tonsillare in toto	-+	+ +
cc. 1	+ ++	-+
Frazione 0,4	+ +	+ +
cc. 0,25	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 0,4	+ +	+ +
cc. 0,50	+ +	+ +
	++	++
Frazione 0,4	+ +	+ +
cc. 0,75	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 0,4	- +	- +
cc. 1 .	-+	+ +
	+ +	+ +

Come si osserva ad elevate concentrazioni di proteine la frazione 0,4 mostra una discreta attività antianafilattica in quanto non si è osservata la comparsa di uno shock anafilattico classico, bensì di una sindrome a carattere anafilattoide. Anche dal punto di vista locale è stato possibile osservare una modica riduzione delle lesioni le quali peraltro sembravano più circoscritte.

Nella tabella IV sono riportati poi i valori dell'attività antianafilattica svolta dalla frazione tonsillare 0,6. E’ ben chiaro che in questo caso alle medie ed alte concentrazioni l'attività è evidente e si rende manifesta sia sui fenomeni a carattere generale, peraltro gli animali hanno presentato uno shock anafilattico ridotto che su quelli a carattere locale, ove la reazione presentava una modesta estensione ed era di minore entità.

TABELLA IV

Reazione generale /Reazione locale

shock

papula

Controllo

+ +

+ +.

(siero di cavallo)

+ +

+ +

+ +

+ +

Estratto tonsillare in toto

- +

- +

cc. 1

- +

-,

+ +

+ +

Frazione 0,6

+ +

+ +

cc. 0,25

+ +

+ +

+ +

+ +

Frazione 0,6

+ +

+ +

cc. 0,50

+ +

+ +

-+

++

Frazione 0,6

+ +

+ +

cc. 0,75

- +

+ +

- +

- +

Frazione 0,6

-+

+ +

cc. 1

-+

-+

-+

-+

Un altro fatto degno di interesse è che l'azione protettiva in questo caso ha cominciato a manifestarsi molto precocemente e pertanto anche alla concentrazione di cc. 0,5 cioè alla metà delle dosi finora impiegate, si comincia già ad osservare una attenuazione di taluni segni. Lo stesso comportamento è stato osservato anche quando l'iniezione scatenante è stata effettuata localmente, soltanto che in questo caso mancano alcuni elementi di valutazione a tipo quantitativo ed abbiamo preferito non tenerne conto.

Infine nella tabella V sono riportati i risultati relativi agli esperimenti compiuti con la frazione 0,8. Anche in questo caso si assiste ad una attenuazione dell'anafilassi determinata dall'iniezione di siero di cavallo, pur tuttavia l'azione è molto fugace ed è di più che modesta entità.

Va anche notato che nessuna modificazione è stata riscontrata a carico della reazione locale, in quanto la papula per estensione ed entità mostrava una perfetta identità ai controlli.

TABELLA V.

	Reazione generale	Reazione locale
	shock	papula
Controllo	+ +	+ +
(siero di cavallo)	+ +	+ +
	+ +	+ +
Estratto tonsillare in toto	+ +	+ +
cc. 1	- +	- +
	- +	- +
Frazione 0,8	+ +	+ +
cc. 0,25	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 0,8	+ +	+ +
cc. 0,50	+ +	+ +
	++	++
Frazione 0,8	- +	+ +
cc. 0,75	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 0,8	- +	+ +
cc. 1	+ +	+ +
	+ +	+ +

Discussione e conclusioni

I risultati che abbiamo riportato indicano che le proteine solubili estratte dal tessuto tonsillare esercitano una modesta azione antianafilattica, concordemente a quanto da noi già riportato in un precedente lavoro.

Abbiamo cercato di frazionare il materiale proteico al fine di localizzare a quale componente fosse legata precipuamente l'attività. Da quanto abbiamo esposto risulta che tutte le frazioni ottenute mediante precipitazione con solfato di ammonio sono capaci di mostrare questa peculiare proprietà.

Pur tuttavia considerando dal punto di vista quantitativo i risultati appare chiaro che una frazione soprattutto contiene in sé una spiccata attività antianafilattica, e cioè la frazione ottenuta allo 0,6 per cento di saturazione del sale. In queste condizioni non solo l'azione, relativamente alle altre frazioni è massima, ma comparativamente all'estratto tonsillare non frazionato è più alta. Ciò vuol dire che con il nostro sistema di isolamento siamo riusciti a concentrare relativamente il principio attivo; infatti in ogni prova si è sempre sperimentato alla stessa concentrazione proteica.

Nel grafico della figura 1 è riportato l'andamento dell'attività antianafilattica di un estratto tonsillare in funzione della saturazione con solfato di ammonio. E’ evidente che più componenti proteici devono essere i responsabili dell'attività, ma comunque il fatto di fondamentale importanza è che, in ogni caso dobbiamo avere a che fare con individualità proteiche del tipo delle globuline.

FIGURA 1
Variazione dell'attività antianafilattica dell'estratto di tonsilla in funzione della concentrazione di solfato di ammonio. Sull'ordinata i valori percentuali della attività antianafilattica; sull'ascissa le concentrazioni di solfato d'ammonio espresse in percentuale di saturazione.

Infatti è noto ormai da tempo che tra 0,4 e 0,7 di saturazione di solfato di ammonio precipitano le globuline, mentre intorno al 100 % di saturazione precipitano le albumine.

Un altro fatto che risulta degno di rilievo è che contrariamente a quanto da noi osservato in un precedente lavoro, l'attività antianafilattica delle frazioni proteiche da tonsilla è più spiccata per l'anafilassi di tipo generale ed è più modesta nel caso di fenomeni anafilattici localizzati a piccoli distretti dell'organismo. Questa apparente discrepanza esistente tra i risultati ottenuti impiegando l'estratto tonsillare in toto e le proteici sono in corso ed i risultati verranno riferiti in un lavoro successivo.

BIBLIOGRAFIA

OTTO R.: Von Leuthold Gedenkschr., 1905, 3, 1. ROSENAU M. e ANDERSON J.: Jour. Infect. Dis., 1908, 5, 85. BESREDKA A.: Ann. Inst. Pasteur, 1907, 21, 384. GAY F. e SOUTHARD E.: Jour. Med. Res., 1908, 19, 17. BENACERAFF B. e FISCHEL E.: Proc. S. Ex. Biol. N.Y., 1949, 71, 349. FRIEDMAN e SILVERMAN I.: Am. Rev. Tuber., 1949, 60, 354. PONTI L. (In corso di stampa): Attività antianafilattica dell'estratto di tonsilla.

IPPOCRATEIOS

Mensile di medicina e chirurgia

Editrice SOPI - Roma

ippocrateios@sopi.it

Reazione generale /Reazione locale
	shock	papula
Controllo	+ +	+ +.
(siero di cavallo)	+ +	+ +
	+ +	+ +
Estratto tonsillare in toto	- +	- +
cc. 1	- +	-,
	+ +	+ +
Frazione 0,6	+ +	+ +
cc. 0,25	+ +	+ +
	+ +	+ +
Frazione 0,6	+ +	+ +
cc. 0,50	+ +	+ +
	-+	++
Frazione 0,6	+ +	+ +
cc. 0,75	- +	+ +
	- +	- +
Frazione 0,6	-+	+ +
cc. 1	-+	-+
	-+	-+